血红蛋白含量的测定是在被稀释的血液中加入溶血剂后，使红细胞释放出血红蛋白，后者与溶血剂中有关成分结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长（一般在530-550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例，仪器便可显示Hb浓度。

不同系列的血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物也不同，但大多数的最大吸收光谱接近540nm。因为国际ICSH推荐的氰化高铁（HiCN）法，其最大吸收峰在540nm，仪器的校准必须以HiCN值为准。近年来许多高档的分析仪上采用了激光散射法进行单个血红细胞血红蛋白的分析，以尽量减少高WBC、乳糜血、高胆红素等对HBG比色的影响。